Кластерно-таксономический анализ микробных сообществ почв Западно-Казахстанской области с помощью методов современной метагеномики

PDF файл (Скачать)

МРНТИ 68.05.31

№4 (2014 г.)

Н.Х. Сергалиев, к.б.н., Е.Е. Андронов, к.б.н.,А.Г. Пинаев, М.Г. Какишев, А.Т. Жиенгалиев, М.А.Володин, А.Ж.Турбаев

Западно-Казахстанский аграрно-технический университет им. Жангир хана г. Алматы, Казахстан

Аннотация. В статье приведена апробация методики выделение ДНК почвенной микробиоты на примере каштановых почв (Kastanozems) Западно-Казахстанской области. Был проведен таксономический анализ библиотек почвенного микробиома, согласно которому наибольшую долю в микробных сообществах проанализированных почв составляют филумы Actinobacteria и Proteobacteria. Заметную долю в составе микробиомов исследованных образцов занимают археи. Ключевые слова: Микробиом, почвенные микроорганизмы, ПЦР, секвенирование, таксономия, тип почвы, ДНК, агроэкология, мониторинг, молекулярная биология, 16s рРНК, метагеном.

________________________________

Сергалиев Н.Х., Андронов Е.Е., Пинаев А.Г., Какишев М.Г., Жиенгалиев А.Т., Володин М.А., Турбаев А.Ж. ҚАЗІРГІ ЗАМАНҒЫ МЕТАГЕНОМИКА ӘДІСТЕРІНІҢ КӨМЕГІМЕН БАТЫС ҚАЗАҚСТАН ОБЛЫСЫНЫҢ ТОПЫРАҒЫ МИКРОБТЫ БІРЛЕСТІГІНІҢ КЛАСТЕРЛІ-ТАКСОНОМИКАЛЫҚ ТАЛДАУЫ

Түйіндеме Мақалада Батыс Қазақстан облысының топырағының (Kastanozems) мысалында топырақ микробиотының ДНҚ бөлу әдістемесін тексеру жүргізілді. Топырақтық микробиом жиынтығының таксономикалық талдауы жүргізілді, оған сәйкес зерттелген топырақ үлгілерінің микробты бірлестіктерінде Actinobacteria және Proteobacteria филумдары көп үлеске ие. Зерттелген үлгілердің микробиомдарының құрамында айтарлықтай үлесті археилар иеленген. Түйінді сөздер: микробиома, топырақ микроағзалары, ПЦР, секвенирлеу, таксономия, топырақ түрі, ДНҚ, агроэкология, мониторинг, молекулярлы биология, 16s рРНК, метагеном.

__________________________________

Sergaliev N. K., Andronov E.E., Pinaev A. Gkakishev ., M. G., Zhiengaliev A. T., Volodin M. A., Turbaev A.Zh. CLUSTER-TAXONOMIC ANALYSIS OF MICROBIAL COMMUNITIES OF SOIL IN WEST KAZAKHSTAN USING THE METODS OF MODERN METAGENOMICS

Abstract. The article presents the results of research on the use of the soil microbiota condition as an indicator of the agro-ecological condition of the soil. We carried out a taxonomic analysis of the soil microbiome libraries, according to which the Actinobacteria and Proteobacteria phyla dominate the microbial communities of the analyzed soils. The Archaea form a large part of the microbiome of the studied samples. Key words: Microbiome, soil microorganisms, PCR, sequencing, taxonomy, soil type, DNA, agroecology, monitoring, molecular biology, 16s rRNA, metagenome

Введение. Традиционные методы анализа почвы дают весьма грубые и неоднозначные результаты. Так, например, почвы с одними и теми же агрохимическими характеристиками могут иметь кардинальные различия в плодородии. Ответственными за такие различия часто являются трудно-выявляемые факторы. Например, при почвоутомлении. В настоящей работе для характеристики почв выбран ее микробиом, главной составной частью которого, является геномный пул микроорганизмов – та частью почвы, которая наиболее чутка к любым изменениям. На сегодняшний день исследования в области молекулярной экологии микроорганизмов объединяются под общим названием - метагеномные исследования. Объектом изучения метагеномики является метагеном – генетический материал, полученный непосредственно из окружающей среды без предварительного культивирования микроорганизмов.

Основная идея, лежащая в основе исследований - анализ структуры почвенного микробиома с использованием методов современной метагеномики как чувствительного индикатора состояния почвы, в котором отражается весь комплекс ее свойств, включая биологические, а также широкий ряд трудно учитываемых или неучитываемых факторов, влияющих на почвенное плодородие и сельскохозяйственный потенциал почв. [1,2,3]. Предлагаемый проект является пионерским и не имеет аналогов в Казахстане, вместе с тем, по крайней мере, два европейских консорциума ведут исследовательские работы в данном направлении.

Методика. Отбор проб почв проводился согласно ГОСТ 17.4.4.02-84. Для проведения молекулярно-биологических исследований микробиома почвенных образцов была применена типичная схема эксперемента. Схема типичного эксперимента заключается в выделении и очистке совокупной ДНК из образца, отобранного из окружающей среды, ПЦР-амплификации определенных участков генома, их клонировании с последующим определением и анализом нуклеотидных последовательностей (секвенированием). Дальнейший анализ полученных нуклеотидных последовательностей предполагает их таксономическую характеристику (путем сравнения с образцовыми базами данных), сопоставление библиотек друг с другом, вычисление коэффициентов генетического разнообразия и.т.д. Для выделения ДНК из почвы нами была применена методика основанная на экстракции c последующей очисткой методом электрофореза в агарозном геле и выделения из блоков агарозы, содержащей ДНК, с абсорбцией на тонкодисперсной окиси кремния [4].

Сравнительный кластерно-таксономический анализ библиотек полученных из нативных почв проводили на сайте RDP () с использованием расстояния по Morisita-Horn, кластеризация по алгоритму UPGM.

Результаты и их обсуждения В ходе работ была создана коллекция из 20 образцов почв, относящихся к основным типам почв Западно-Казахстанской области, представляющих собой целинные земли (Таблица). Данные об отобранных пробах приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Пробы почв Западно-Казахстанской области

Тип почв	Место отбора	Образец	GPS координаты	Глубина отбора
Солонец каштановый	п. Актау	01_SOLON_AKT_1	N50º56.869´ E 051º07.938´	0-10 см
		02_SOLON_AKT_1		10-20 см
Темно-каштановая неполноразвитая	п. Актау	03_TKASHT_AKT_2	N51º00.150´ E 050º09.025´	0-10 см
		04_TKASHT_AKT_2		10-20 см
Темно-каштановая малоразвитая	п. Актау	05_TKASHT_AKT_3	N51º00.532´ E 051º18.278´	0-10 см
		06_TKASHT_AKT_3		10-20 см
Солончак	п. Новопавловка	07_SOLON_NVPL_4	N51º05.473´ E 051º42.515´	0-10 см
		08_SOLON_NVPL_4		10-20 см
Лугово-каштановые	п. Новопавловка	09_LKASHT_NVPL_5	N51º08.774´ E 051º39.234´	0-10 см
		10_LKASHT_NVPL_5		10-20 см
Темно-каштановая среднемощная	п. Новопавловка	11_TKASHT_NVPL_6	N51º06.823´ E 051º39.694´	0-10 см
		12_TKASHT_NVPL_6		10-20 см
Светло-каштановые	п. Талдыапан	13_SKASHT_TLD_7	N49º33.450´ E 050º16.249´	0-10 см
		14_SKASHT_TLD		10-20 см
Каштановая	п. Кушум	15_KASHT_KUSH_8	N50º52.599´ E 051º06.489´	0-10 см
		16_KASHT_KUSH_8		10-20 см
Чернозём южный	п. Щукино	17_CHRZ_SHUK	N51º40.301´ E 050º48.889´	0-10 см
		18_CHRZ_SHUK		10-20 см
Пойменная каштановая	ЗКО г. Уральск пойма реки Урал	19_POJM_URA	N51º07.731´ E 051º21.848´	0-10 см
		20_POJM_URA		10-20 см

Из данных образцов была получена тотальная ДНК.

Рис. 1 - Почвенная ДНК

Как видно из рисунка 1, скорости электрофоретической миграции гуминовых компонентов гораздо выше, чем скорость миграции фракции ДНК (рис.1). Именно на этой особенности основана дальнейшая очистка препарата ДНК. Процесс отделения гуминовых компонентов ясно виден в геле во время электрофореза при обычном освещении. Затем вырезают блок агарозы, содержащий ДНК, и проводят окончательную очистку препарата методом с сорбцией ДНК на окиси кремния [5,6].

Определение концентрации ДНК показало, что метод позволяет выделять до 2-5 мкг ДНК из 1 г почвы, что свидетельствует о высоком выходе. Кроме того, выделенная ДНК отличается высокой чистотой (для почвенной ДНК), так как эффект ингибирования не наблюдается при концентрации ДНК в реакции ПЦР до 0,2 нг/мкл.

Было проведено исследование почвенного микробиома высокопроизводительным секвенированием. С использованием 20 мультиплексных fusion-праймеров и почвенной ДНК. Их концентрации были выровнены с использованием гель-денситометрии, затем амплификаты были объединены, переочищены путем выделения суммарной библиотеки из геля. После очистки суммарной библиотеки ее концентрация была нормирована на 10 млн. копий фрагмента гена 16S рРНК на мкл с использованием точного определения концентрации на флюориметре (краситель SYBR-gold, прибор QUBIT, Invitrogen). Секвенирование библиотеки было проведено в точном соответствии с рекомендациями к прибору GS Junior (Roche).

При анализе по доменальному распределению во всех образцах выявлено два основных домена – домен Bacteria и Archaea причем с явным преобладанием первого домена. Проводя кластерно-филумный анализ выявлено 27 филумов, явно преобладающие филумы Actinobacteria 23 – 38 % , Proteobacteria 9-48 %, а так же неатрибутируемые филы 13-32%. При проведении кластерного анализа распределения по классам выявлено 63 класса из которых 15 неатрибутируемые. Распределение микробов по отрядам составило 110 отрядов из них 28 отрядов неатрибутируемые. Доминирующим отрядом так же является Actinomycetales из класса Actinobacteria 5-13 % и 13 – 32 % неатрибируемых Bacteria по отрядному и вышестоящей классификации.Выявлено 215 семейств из них преобладают неатрибируемые 47 семейств бактерий с частотой распределения 13-32%, когда как других семейств менее 10% .

При кластеризации по родовому распределению выявлено 474 рода из них 126 неатрибируемые, число распределения их по образцам почв варьирует 15-32 %, когда как других родов не более 5 % в образце.

Так же мы провели построение кластерного дерева по семействам и родам. Деревья построены по результатам кластерного анализа – по родам, также с учетом неатрибутируемых таксонов и соответствующий родству по агрохимическим показателям (рис. 2).

Рис. 2 Кластерный анализ микробиома нативных почв Западно-Казахстанской области

Выводы. В ходе проведенных исследований, выявлено то что неатрибутируемых последовательностей в почве очень много, причем чем ниже ранг, тем их больше больше, они могут иметь самое важное значение при попытках связать свойства почвы с ее характеристиками. Проведен кластерный анализ нативных почв от домена до рода. Отмечается явная тенденция увеличения неатрибируемых бактерий в образцах почв анализируя распределение бактерий от филумов до рода. Возможно, данные бактерии играют важную роль в оценке микробиома и его связи с агрохимическим состоянием почвы.

Проводимые работы выполнялись в целях реализации научно-исследовательского проекта «Использование методов современной метагеномики в оценке агроэкологического состояния почв Западного Казахстана» в рамках бюджетной программы 055 «Научная и/или научно-техническая деятельность», номер государственной регистрации - 0112РК00513

Список литературы

1 Brajesh, K. Singh, Soil genomics [Text] / Colin D. Campbell, Soren J. Sorenson et al. // Nature Reviews Microbiology – 2009. – V.7 – P. 756. – ISSN 1740-1526.

2 Gerlach, W. WebCARMA: a web application for the functional and taxonomic classification of unassembled metagenomic reads [Text] / S. Jünemann, F. Tille // BMC Bioinformatics. – 2009. – V.10. – P.430. - ISSN 1471-2105.

3 Warnecke, F. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite [Text] / P. Luginbühl, N. Ivanova // Nature. – 2007. – V.450. – P. 560 – 565. – ISSN 0028-0836.

4 Сергалиев Н.Х., Андронов Е.Е., Пинаев А.Г., Какишев М.Г., Захарян Р.А. Использование методов современной метагеномики в оценке микробиоты почв Западно-Казахстанской области // Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2013. – № 1 (57). – С. 133-138.

5 Andronov E.E., Petrova S.N., Pinaev A.G., Pershina E. V., Rahimgalieva S.Zh., Ahmedenpv K. M., Gorobec A. V., Sergaliev N. H. Research the structure of microbial community in soils of different degrees of salinity using T-RFLP and Real-Time PCR// Eurasian soils. – 2012. - № 2. - P. 173-183.

6 Сергалиев Н.Х., Захарян Р.А. , Какишев М.Г. Применение молекулярно-биологических методов при исследовании почвенно-микробиологических процессов // Наука и образование. – 2013. – № 1 (30). – С. 27-29.

Создатель : Лариса Николаевна Гребцова

Создан : 22 августа 2024