30 сентября 2014 
Лариса Николаевна Гребцова | УДК 57.08 | №3 (2014г.) | МРНТИ 34.05.25 |
С.С. Ануарбекова, Э. Нагызбеккызы, С.С. Даулбай, Г.К. Абитаева, Н.Е. Бекенова
Республиканская коллекция микроорганизмов,
г. Астана, Казахстан
Аннотация. Благодаря своей способности фиксировать молекулярный азот, тем самым повышая плодородие почвы и стимулирования роста растений представители рода Agrobacterium и Rhisobium используются в сельском хозяйстве для получения азотных биоудобрений. Необходимым условием успешной работы с микроорганизмами является правильное поддержание их с целью сохранения не только жизнеспособности клеток, но и таксономических и производственных свойств. В статье представлены данные по отработке условий лиофильного хранения культур микроорганизмов, обладающих азотфиксирующими свойствами. Работа выполнялась с применением классических методов микробиологии. Отрабатывались два варианта лиофилизации с использованием трех защитных сред на основе желатины. При всех разновидностях высушивания показатели стабильны, в пределах 10-7 КОЕ/мл. Это свидетельствует об их эффективности. В дальнейшей работе можно делать выбор при применении той или иной защитной среды. Полученные данные будут использованы на практике для длительного хранения азотфиксирующих микроорганизмов методом сублимационной сушки.
Ключевые слова: азотфиксирующие микроорганизмы, лиофильное хранение, микробиология
Ануарбекова С.С., Нағызбекқызы Э., Даулбай С.С., Абитаева Г.К., Бекенова Н.Е.
АЗОТФИКСИРЛЕЙТІН МИКРООРГАНИЗМДЕРДІ ЛИОФИЛЬДІ САҚТАУ ШАРТТАРЫН ЖАСАУ
Түйіндеме. Молекулярлы азотты фиксирлейтін қасиетінің қабілеттілігі арқасында топырақ құнарлығын көтеру және өсімдік өсуін ынталандыруда Agrobacterium және Rhisobium түрлері ауыл шарушылығында азотты биотыңайтқыш алу үшін ретінде қолданылады. Микроорганизмдермен жақсы жұмыс жасауда қажетті шарты оларды сақтау мақсатында тек қана жасуша өміршеңдігін сақтау емес, таксономикалық және өндірістік қасиетін қолдау болып табылады. Мақалада азотфиксирлейтін қасиеттеріне ие микроорганизмдер культураларын лиофильді сақтау шарттарын жасаудағы мәліметтер көрсетілген. Жұмыс микробиологияның классикалық әдістерін қолдану арқылы орындалды. Желатин негізіндегі үш қорғау ортаны қолданумен лиофилизацияның екі нұсқасы жасалды. Әр түрлі кептірудегі көрсеткіштер тұрақты, 10-7 аралығында. Бұл олардың эффективті екенін растайды. Әрі қарай жұмыста екі қорғау ортасын қолдануға таңдау жасауға болады. Алынған мәліметтер тәжірибеде сублимациялық кептіру әдісімен азотфиксирлейтін микроорганизмдерді ұзақ уақыт сақтау ішінде қолданылатын болады.
Түйінді сөздер: азотты фисирлейтін микроағзалар, лиофильді сақтау, микробиология
Anuarbekova S.S., Nagyzbekkyzy E. Daulbaev S.S., Abitaeva G.K., Bekenova N.E.
WORKING OFF CONDITIONS LIPOPHILIC STORAGE OF NITROGEN-FIXING MICROORGANISMS
Abstract. Due to its ability to fixation molecular nitrogen, thereby increasing soil fertility and stimulate growth of the plants, genus Agrobacterium and Rhisobium used in agriculture to produce nitric biofertilizer. A necessary condition of successful work with microorganisms is properly maintaining them with the aim of preserving not only the viability of the cells, but the taxonomic and industrial properties. The article presents the data on improvement of conditions of lyophilic storage of cultures of microorganisms with nitrogen-fixing properties. The work was carried out with the use of classical methods of Microbiology. Perfected two options lyophilization using three protective environments on the basis of gelatin. The study revealed that in all varieties of drying the viability of a stable, within 10-7 CFU/ml. Is indicative of their performance. In further work, you can make a choice with the application of a protective environment. The obtained data will be used in practice for long-term storage of nitrogen-fixing microorganisms method of freeze drying
Key words: nitrogen-fixing bacteria, freeze-storage, microbiology
Введение. Практическое применение современных биологических знаний, интенсивное развитие биотехнологии открывает возможность решения важнейших проблем здравоохранения, ветеринарии, фармакологии, пищевой промышленности, аграрного сектора, охраны окружающей среды. Благодаря научным достижениям микробиологии, внедрению новых разработок генной инженерии стало возможным получение высокотехнологичных штаммов микроорганизмов с повышенной продуктивностью [1-6]. Неотъемлемым компонентом фундаментальной базы практически любого биотехнологического проекта являются коллекции культур.
Основными требованиями к поддержанию культур в коллекции является сохранение их жизнеспособности (ЖСП), аутентичности, чистоты, соответствие научных названий штаммов современной номенклатуре.
В ведущих коллекциях мира для поддержания ЖСП микроорганизмов применяется несколько методов, которые можно разделить на 2 группы: поддержание штаммов в метаболически активном состоянии (субкультивирование и хранение под слоем минерального масла) и метаболически неактивном состоянии (лиофилизация и криоконсервация). Обязательным требованием является использованием как минимум 2-х методов хранения. Данное требование выполняется и в РКМ, где применяются такие методы хранения как лиофилизация, криоконсервация, субкультивирование на скошенных агаризованных средах и субкультивирование под минеральным маслом.
Одной из трудных задач бактериологии является сохранение микробов в том состоянии, в каком они были выделены. Содержание и пассажи на искусственных питательных средах способствуют изменчивости микроорганизмов и их вырождению. Поэтому в целях сохранения культур микробов исследователи стараются применять методы, которые исключают размножение и снижают процессы обмена. К таким методам относится лиофилизация [7].
Хранение лиофильно высушенных клеток – широко распространенный метод длительного сохранения микроорганизмов. Лиофилизацией называют процесс высушивания под вакуумом замороженных клеток. Лиофильно-высушенные клетки сохраняются во флаконах и в ампулах, запаянных под вакуумом или в струе стерильного газа (чаще всего азота). Применение этого метода позволяет в течение 10-20 лет и более сохранить без заметных изменений ЖСП, морфологические, культуральные, физиологические свойства, а также биохимическую активность клеток и производственную ценность [8].
Итак, коллекции культур микроорганизмов гарантируют сохранение ресурсов микробного разнообразия, обеспечивают их патентноохранность и обеспечивают ими потребность образования, науки и производства.
Биологические запасы коллекций истощают себя. Для пополнения коллекций культур микроорганизмов перспективными для прикладной и научной деятельности штаммами необходимо проводить работы по получению новых штаммов путем выделения их и селекции, что постоянно проводится.
Одним из направлений развития народного хозяйства является растениеводство, направленное на прирост урожая различных культур, защита их от вредителей и от заболеваний инфекционной природы. В современной системе земледелия приоритет должен отдаваться экологически безопасным природоохранным технологиям возделывания сельскохозяйственных культур. В связи с этим всевозрастающее значение приобретают биопрепараты на основе агрономически полезных микроорганизмов. Наилучшими считаются полифункциональные биопрепараты с длительным сроком сохранности оптимального количества жизнеспособных клеток, экономичные при изготовлении и удобные в использовании. Исходя из этого, важным этапом является подбор и оптимизация питательных сред, субстратов и условий культивирования бактерий [9-17].
Среди процессов, от которых зависит биологическая продуктивность, одним из важнейших является фиксация микроорганизмами азота атмосферы. Проблема биологической азотфиксации относится к числу основных проблем сельскохозяйственной и биологической науки за счет того, что содержание доступного растениям азота в почве обычно невелико. Поэтому повышение урожайности сельскохозяйственных растений связано в первую очередь с улучшением их азотного питания.
Дефицит азота в значительной степени компенсируется биологическим путем, в основном за счет запаса азота, аккумулированного в почве микроорганизмами, в первую очередь азотфиксирующими. Многие сельско-хозяйственные объединения с черноземными землями, не используют минеральные удобрения и получают удовлетворительные урожаи. По расчетам же, за это время почвы должны были бы потерять весь находящийся в них азот. В том, что этого не происходит, заслуга культур микроорганизмов, обладающих азотфиксирующими свойствами.
Существуют две группы фиксирующих атмосферный азот микроорганизмов. Одна из них находится в симбиозе с высшими растениями, образуя клубеньки на корнях. К этой группе относятся клубеньковые бактерии. Микроорганизмы другой группы обитают в почве независимо от растений. К ним относятся азотобактер, клостридиум, бейеринкия и другие свободноживущие микроорганизмы. Потенциальные возможности симбиотических азотфиксаторов значительно выше, чем свободноживущих.
Следовательно, целью работы является отработка условий хранения азотфиксирующих культур микроорганизмов методом лиофилизации для сохранения их свойств.
Методы исследований
Метод лиофилизации
Микроорганизмы выращивали в оптимальных условиях и затем их суспендировали в защитных средах. Полученную суспензию разливали в пенициллиновые флаконы из нейтрального стекла по 1-2 мл, замораживали при низких температурах, затем высушивали на аппарате лиофильной сушки [8, 9].
Оценка показателя жизнеспособности культур микроорганизмов по методу Р. Коха
Определение числа микроорганизмов этим методом [9] включает три этапа:
- приготовление разведений;
- посев на плотную среду в чашки Петри;
- подсчет выросших колоний.
Лучшим разведением считается то разведение, где наблюдается рост от 30-50 до 100-150 колоний. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из разведения на одной чашке.
Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:
М=а·10n / V,
где М – количество клеток в 1 мл; а – среднее число колоний при высеве разведения, из которого сделан высев; V – объем суспензии, взятый для посева, в мл; 10n — коэффициент разведений.
Результаты и их обсуждение
Объектами исследования являются 5 азотфиксирующих культур, представленные родами Agrobacterium и Rhisobium.
Для лиофилизации использовали аппарат лиофильного высушивания BenchTop Virtis (США).
Перед закладкой на хранение методом лиофилизации была дана оценка максимального показателя ЖСП. Допустимая цифра выживаемости микробных клеток, внедряемых в производство и депонируемых в коллекции должна соответствовать 107 и более для того, чтобы они в дальнейшем не утратили данную активность и не были утеряны сами.
Культуры обладают допустимыми требованиями (не менее 10-7): 10-7 — 10-10.
Для сохранения ЖСП бактериальных клеток в период лиофилизации и последующего хранения большое значение имеют состав защитной среды, остаточная влажность препаратов, температура хранения.
Основная роль защитной среды заключается в защите клеток от повреждений, поддержании их максимального показателя выживаемости и сохранении их производственной ценности.
В ходе работы над параметрами лиофильного высушивания нами отработаны два варианта лиофилизации, которые представлены в схеме рисунка.
II вариант лиофилизации отличается от I-го варианта этапом замораживания культур: после замораживания при минус 20 °С в течение 2-х часов закладывали на замораживание при минус 80 °С в течение 2-х суток.
Рисунок – Схема I и II варианта лиофильного высушивания
азотфиксирующих микроорганизмов
Остаточная влажность препаратов в обоих случаях составляла 3,0-4,0 % (допустима в пределах 1-6 %). После лиофилизации флаконы хранили при температуре минус 20°С.
При этом применяли 3 защитные среды:
1 среда – желатинозно-сахарозная среда Файбича: 1/10;
2 среда — среда с 8 % сахарозы и 4 % тиомочевины;
3 среда — 20 % сахароза.
Результат выживаемости азотфиксирующих бактерий представлен в таблице.
Результат выживаемости азотфиксирующих бактерий представлен в таблице.
Таблица – Выживаемость азотфиксирующих микроорганизмов при лиофилизации (КОЕ/мл)
|
Наименование культур |
1 вариант |
2 вариант |
||||
|
1 среда |
2 среда |
3 среда |
1 среда |
2 среда |
3 среда |
|
| A. tumefaciens Z-2 |
10-8* 10-8 25×10-8 10-8 |
10-8 10-8 25×10-7 10-7 |
10-8 10-8 75×10-7 10-7 |
10-8 10-8 10×10-7 10-7 |
10-8 10-8 15×10-7 10-7 |
10-8 10-8 5×10-7 10-7 |
| A. tumefaciens Z-4 |
10-7 10-7 10-7 10-7 |
10-7 10-7 10×10-6 10-6 |
10-7 10-7 10-7 10-7 |
10-7 10-7 10-8 10-7 |
10-7 10-7 10-7 10-6 |
10-7 10-7 10-7 10-7 |
| R. pusense Z-5 |
3,75×10-8 3×10-8 75×10-7 65×10-7 |
3,75×10-8 3,5×10-8 70×10-7 10×10-7 |
3,75×10-8 3×10-8 1×10-8 75×10-7 |
3,75×10-8 5×10-8 10×10-7 10-7 |
3,75×10-8 3×10-8 2×10-8 10-7 |
3,75×10-8 3,75×10-8 68×10-7 5×10-7 |
| R. pusense Z-8 |
7,5×10-9 5×10-9 55×10-8 5×10-8 |
7,5×10-9 5×10-8 5×10-7 5×10-7 |
7,5×10-9 1,5×10-9 10-9 15×10-8 |
7,5×10-9 10-9 10-9 55×10-8 |
7,5×10-9 10×10-9 5×10-9 10×10-8 |
7,5×10-9 7,5×10-9 10×10-8 1×10-8 |
| A. tumefaciens Z-9 |
7,5×10-10 7,5×10-10 7×10-9 42×10-8 |
7,5×10-10 3×10-10 5,5×10-9 10-8 |
7,5×10-10 10-10 10-10 5×10-8 |
7,5×10-10 10-10 10-9 25×10-8 |
7,5×10-10 7,5×10-9 5×10-9 55×10-8 |
7,5×10-10 23×10-10 4×10-9 55×10-8 |
Примечание: * — Столбиком сверху вниз представлены цифры ЖСП: исходные показатели, через 1 месяц, 3 месяца и через 6 месяцев хранения.
Оценивали результаты 2-х вариантов лиофилизации с использованием 3-х разновидностей защитных сред. В целом показатели стабильны, наблюдалось некоторое снижение ЖСП в пределах 1-2 порядков, но в пределах допустимой нормы – до 10-7.
Выводы. Таким образом, были опробованы различные условия лиофильного метода хранения к штаммам бактерий рода Agrobacterium и Rhisobium.
В процессе оценки эффективности лиофилизации установлено, что оба варианта дают положительный результат, но рациональнее использовать 1 вариант, который короче по времени проведения процедуры на 48 часов, что дает более быструю по срокам закладку на хранение азотфиксирующих микроорганизмов методом лиофилизации.
Все три исследуемые нами защитные среды эффективны, то есть сохраняют культуры в активном состоянии. В дальнейшем при выборе среды для лиофильного высушивания азотфиксирующих микроорганизмов можно выбор сделать на более дешевую среду.
Данные, полученные в ходе работы, вносят вклад в развитие коллекционного дела и будут использованы на практике в Республиканской коллекции микроорганизмов для длительного хранения азотфиксирующих микроорганизмов методом лиофильного высушивания.
Список литературы
1 Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. – 3-е изд. – М.: Академия, 2006. – 208 с.
2 Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И. Биотехнология. – М.: Академия, 2006. – 254 с.
3 Шлегель Г.Г. Общая микробиология: Пер. с нем. — М.: Мир, 1987. — 567 с.
4 Бери Д. Биология дрожжей – М.: Мир, 1985. — 95 с.
5 Дудикова Г.Н. Биотехнологические основы использования лактобацилл для защиты зернопродуктов от бактериальной контаминации: Дисс. докт. биол. наук. — Алматы, 2002. — 320 с.
6 Каталог культур микроорганизмов. – Астана, 2003. — 186 с.
7 Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. и др. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студ. ВУЗ-ов / Под ред. А.И. Нетрусова. – М.: Академия, 2005. – 608 с.
8 Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Под ред. Н.С. Егорова. – М.: Московский Университет, 1995. – 220 с.
9 Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. – М.: Наука, 1985. – 296 с.
10 Церковняк Л.С., Курдиш И.К. Bacillus subtilis ИМВ В-7023 – перспективный продуцент БАВ для растениеводства // Міжнародна наукова конференція «Мікробні біотехнології»: Тези доповідей. — Одеса: Астропринт, 2006. – С. 104.
11 Булавенко Л.В., Курдиш И.К. Фосфатазная активность Bacillus subtilis ИМВ В-7023 // Мікробіол. журн. – 2005. – 67. — № 4. – С. 21-27.
12 Грязнева Т.Н. Разработка глубинного способа культивирования бацилл – компонентов пробиотика Биод-5 // Биотехнология. – 2004. – № 5. — С. 67–68.
13 Курдиш И.К. Гранулированные микробные препараты для растениеводства: наука и практика. – К.; КВІЦ. – 2001. – 142 с.
14 Полянская Л.М., Ведена О.Т., Лысак Л.В., Звягенцев Д.Т. Стимуляция роста растений культурами Bejerinkia и Clostridium // Микробиология. – 2002. – Т. 71, № 1. – С. 123-129.
15 Рой А.А., Рева О.Н., Смирнов В.В., Курдиш И.К. Биологические свойства фосфатмобилизирующего штамма Bacillus subtilis ИМВ В-7023 // Прикладная биохимия и микробиология. – 2004. – Т. 40, № 5. – С. 551–557.
16 Рой А.А., Залоило О.В., Чернова Л.С., Курдиш И.К. Антагонистическая активность фосфатмобилизирующих бацилл к фитопатогенным грибам и бактериям // Агроэкологический журнал. – 2005. – № 1. – С. 50-55.
17 Церковняк Л.С., Курдиш И.К. Фосфатмобилизирующие бактерии Bacillus subtilis – продуценты соединений фенольной природы // Прикладная биохимия и микробиология. – 2009. – Т. 45, № 3. – С. 311-317.
Рубрика 
